Die Sammlung umfasst als zeitlichen Rahmen die Steinzeit bis zum späten 18. Jahrhundert. Schwerpunkte liegen in der landesgeschichtlich bedeutenden Epoche der Vereinigten Herzogtümer Jülich-Kleve-Berg (16. und 17. Jahrhundert) sowie in der Regierungszeit der Herzöge von Jülich-Berg aus dem Hause Pfalz-Neuburg (17. bis 18. Jahrhundert). Die Bestände umfassen unter anderem archäologische Fundstücke, Gemälde, Grafiken, Skulpturen, Objekte der angewandten Kunst sowie Archivalien.
Einen deutlichen Schwerpunkt der Sammlung bildet seit der Gründung des Historischen Museums die große Anzahl der Portraits. Besonders hervorzuheben sind die auf Eichenholz gemalten Bildnisse Herzog Wilhelms des Reichen (1591) (Inv.-Nr. B 4) und seines Sohnes Johann Wilhelm (1605) (Inv.-Nr. B 8) von Johan Malthain. Weitere bedeutende Herrscherportraits des Kurfürsten Johann Wilhelm von der Pfalz, oder kurz Jan Wellem, stammen von Jan Frans van Douven. Der von Johann Wilhelm besonders geschätzte Maler portraitierte diesen 1708 im Schmuckharnisch und von den Insignien der Macht umgeben (Inv.-Nr. B 820) sowie posthum den von Krankheit gezeichneten Fürsten (Inv.-Nr. B 174). Neben den Herrscherportraits finden sich Bildnisse berühmter Wissenschaftler in landesherrlichen Diensten, wie das des Gerhard Mercator (Inv.-Nr. B 140). Außerdem besteht eine sehr umfangreiche Kupferstich-Sammlung. In der Sammlungspräsentation nehmen die Kupferstiche des Frans Hogenberg, die die Hochzeit des Herzogs Johann Wilhelm von Jülich-Kleve-Berg mit Jakobe von Baden 1585 illustrieren, eine herausragende Stellung ein. So bilden die teilweise handkolorierten Stiche nicht nur die Festabfolge des achttägigen Festes ab, sondern liefern mit den Ansichten der Düsseldorfer Rheinfront oder des Schlosses bedeutende topografische Bildquellen des 16. Jahrhunderts. (Inv.-Nr. D.V 1-D.V 32)
Stellvertretend für die Möbelsammlung ist der Kölner Schrank aus dem 16. Jahrhundert zu nennen. Der reich mit Intarsien versehene Eichenschrank (Inv.-Nr. M 50) gibt einen Eindruck von der gehobenen bürgerlichen Wohnkultur des 16. Jahrhunderts in Düsseldorf. Zwei Steinschlosspistolen des Hermann Bongard (Inv.-Nr. W 25 und W 26) oder auch das silberne Salzschälchen des Conrad Hadernach (Inv.-Nr. S 1005) demonstrieren exemplarisch die hohe Qualität Düsseldorfer Kunsthandwerks im Umfeld des kurfürstlichen Hofes um 1700.
Seit der Gründung des Stadtmuseums spielt die Archäologie eine besondere Rolle. Sammler wie Carl Guntrum und Constantin Koenen übergaben ihre Bestände an das Haus, im 20. Jahrhundert nahm Kurator Franz Rennefeld an Grabungen in Düsseldorf teil und bis heute können aktuelle Grabungsfunde als Dauerleihgaben des Instituts für Denkmalschutz ausgestellt werden. Das Spektrum umfasst so unterschiedliche Objekte wie eine Käseschüssel aus dem römischen Lager Moers-Asberg (Inv.-Nr. A 123) oder ein Urinalglas zur medizinischen Diagnose aus dem 16. Jahrhundert.
Obwohl in den Inventaren des Stadtmuseums vor allem Archivalien des 19. und des 20. Jahrhunderts verzeichnet sind, gibt es auch hochrangige Stücke aus der Zeit vor 1800. Besondere Beachtung verdient der 1498 datierte Brief des reisenden Ritters Arnold von Harff an seine Landesherrin Sybille von Jülich-Berg, dem Harff einen Pilgerring aus Jerusalem beilegte (Inv.-Nr. ). Neben den beschriebenen Objekten sind mehrere Modelle beachtenswert, so sind Entwicklungsstadien des Düsseldorfer Schlosses vom 14. bis 18. Jahrhundert zu sehen.
